熒光定量PCR的檢測離不開熒光定量PCR試劑和
qPCR熒光定量PCR儀,儀器由熒光定量系統和計算機組成,用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數據。
對于熒光定量PCR儀的評價,相信大家一定是不知道的。熒光定量PCR儀涉及很多溫度、光電信號等,專業(yè)性評估,還有就是不知道從哪里入手。今天我們梳理下在核酸檢測實驗室中如何通過試驗來評價熒光定量PCR儀。
qPCR熒光定量PCR儀的試驗設計:
一、試驗準備
1、有證標準物質:國內外有證標準物質,標準物質類型為質粒DNA或RNA。不推薦使用自制沒有進行定量的質控品。
2、熒光染料:可以選用試劑盒自帶的ROX染料或購買標準熒光染料。
3、熒光定量PCR方法:需要使用經過驗證過的熒光定量方法,擴增效率90%-110%(越接近100%越好);R2大于0.99;檢測限應低于10copies/反應。
4、反應體系:質量高口碑好的反應體系。
5、耗材:儀器推薦使用的專用于熒光定量PCR的耗材。
6、反應條件:常規(guī)熒光定量PCR反應條件,普通模式,40個循環(huán)。不建議使用快速模式和預擴增反應條件。
二、重復性試驗
選擇高中低濃度標準物質進行檢測(推薦濃度為5000copies/反應、500copies/反應和50copies/反應),每個濃度至少5次重復,樣品管隨機放置在反應板中心和邊緣的不同位置。Ct值變異系數不大于3%。
如果qPCR熒光定量PCR儀檢測中使用雙重或多重熒光檢測,可設計如用FAM探針擴增用VIC通道檢測,檢測結果不應該有高于閾值線的熒光信號。